論文解讀--殺鮭氣單胞菌感染大西洋鮭紅細胞 |
| 出處：水生動物健康評估公眾號 作者：龍夢 水產養殖網 2020-04-06 22:46:00 |
殺鮭氣單胞菌是海水和淡水魚癤瘡病病原菌，通過皮膚、腸道或鰓侵入魚體，擴散并定殖于頭腎，肝臟，脾臟和大腦。殺鮭氣單胞菌的毒力與其在巨噬細胞等吞噬細胞中的復制能力有關，且該菌可以侵襲非吞噬上皮細胞并在其中復制，但殺鮭氣單胞菌在魚紅細胞中的侵襲和復制尚不清楚。與哺乳動物的紅細胞不同，魚類紅細胞是有核細胞，并且沒有關于這些硬骨魚紅細胞內細菌感染的報道。土拉弗朗西斯菌、豬支原體、雞支原體和巴爾通體屬被報道可侵入哺乳動物的紅細胞，血原菌和犬嗜血支原體在魚的紅細胞外部定植或附著但并未侵入紅細胞。紅細胞胞內感染可以幫助細菌逃避宿主防御機制，并輕松獲得鐵等必需營養進行增殖。下面介紹的這篇文章運用體內和體外試驗評估了殺鮭氣單胞菌是否具有感染大西洋鮭紅細胞并在其中存活的能力，引用信息如下：
結果
1、大西洋鮭原代紅細胞感染殺鮭氣單胞菌后的生存力和慶大霉素排除分析
圖1. 殺鮭氣單胞菌感染鮭魚原代紅細胞。（a）15oC下，感染不同劑量的殺鮭氣單胞菌后48h內鮭魚原代紅細胞（RBC）的存活率，RBC感染不同的MOI（紅細胞：細菌）；（b）鮭魚原代紅細胞的慶大霉素排除分析：15oC下，相對于初始接種量，感染后1小時（附著）和感染后2小時和3小時（侵襲）殺鮭氣單胞菌的百分比。
為了確定紅細胞感染殺鮭氣單胞菌過程中的生存力，用不同的MOI（紅細胞：細菌）感染鮭魚紅細胞（RBC），在感染后12和48小時確定生存力。鮭魚RBC顯示出對殺鮭氣單胞菌感染的高抗性，MOI在1：100以內的細胞存活率超過80％（圖1a），MOI 為10：1和1：100之間未檢測到顯著差異，但MOI在1：1,000時檢測到顯著差異，在該處理組中，感染后48小時RBC活力下降至20％以下（圖1a）。這些結果表明，殺鮭氣單胞菌在生理相關MOI（1：1）內不會殺死RBC。
使用慶大霉素排除分析，我們評估了殺鮭氣單胞菌是否具有感染鮭魚原代紅細胞并在其中存活的能力。首先，我們評估了殺鮭氣單胞菌在12孔板中附著RBC的能力，與初始接種細菌（1.66 x 107 CFU）相比，附著在RBC上的殺鮭氣單胞菌平均百分比為42.27±11％（7.8 x 106 CFU）（圖1b）。感染后1小時后，用慶大霉素處理以排除細胞外殺鮭氣單胞菌，感染后2小時和3小時殺鮭氣單胞菌百分比為0.047±0.018％（5.90 x 103 CFU）和0.032±0.031％（2.10 x 103 CFU）（與初始接種細菌相比）（圖1b），感染后2小時和3小時之間沒有顯著差異。
2、流式細胞儀（熒光激活細胞分選）
圖2. 熒光激活細胞分選術（FACS）評估殺鮭氣單胞菌感染鮭魚原代紅細胞（RBC）。（a）對照，未感染紅細胞；（b）對照，紅細胞感染未標記的殺鮭氣單胞菌2小時，慶大霉素處理1小時；（c）紅細胞感染DTAF標記的殺鮭氣單胞菌2小時，慶大霉素處理1小時；（d）對照，無標記殺鮭氣單胞菌；（e）對照，DTAF標記的殺鮭氣單胞菌。所有測定均在15oC進行。
圖3. 熒光激活細胞分選術（FACS）評估鮭魚原代紅細胞（RBC）的吞噬作用。（a）紅細胞接種未標記的滅活殺鮭氣單胞菌；（b）紅細胞接種DTAF標記的滅活殺鮭氣單胞菌；（c）紅細胞接種FITC標記的乳膠珠；（d）對照，未標記的滅活殺鮭氣單胞菌；（e）對照，DTAF標記的滅活鮭魚氣單胞菌；（f）FITC標記的乳膠珠。測定在15oC下進行。
我們使用流式細胞儀驗證了慶大霉素排除分析結果。三個重復試驗的流式細胞儀數據顯示，感染后2小時（慶大霉素處理后1小時）DTAF標記的殺鮭氣單胞菌感染紅細胞的平均感染百分比為為0.192±0,074（圖2）。此外，我們發現福爾馬林滅活的DTAF標記殺鮭氣單胞菌和FITC標記的乳膠珠被鮭魚原代RBC吞噬，平均百分比分別為0.140±0.064和0.043±0.025（圖3）。
3、共聚焦顯微鏡檢查感染的紅細胞
圖4. 共聚焦顯微鏡評估殺鮭氣單胞菌感染鮭魚原代紅細胞。（a）DTAF標記的殺鮭氣單胞菌（1000x）;（b）紅細胞用DAPI染色，并用DTAF標記的殺鮭氣單胞菌感染2小時和慶大霉素處理1小時（600x）；（c）紅細胞用DAPI染色，并用DTAF標記的殺鮭氣單胞菌感染2小時和慶大霉素處理1小時（600x；暗視野）；（d）紅細胞用DAPI染色，并用DTAF標記的殺鮭氣單胞菌感染2小時和慶大霉素處理1小時的3D成像。分析在15oC下進行。
為了確定鮭魚原代RBC中細胞內細菌的存在，用DTAF標記的殺鮭氣單胞菌感染RBC（圖4a）。共聚焦顯微鏡顯示殺鮭氣單胞菌侵入鮭魚原代紅細胞（圖4a），殺鮭氣單胞菌位于紅細胞的細胞質中（圖4b-d），沒有觀察到RBC的裂解。3D成像證實殺鮭氣單胞菌位于鮭魚原代RBC的細胞內（圖4d）。
4、殺鮭氣單胞菌感染大西洋鮭和紅細胞定殖
圖5. 鮭魚感染殺鮭氣單胞菌后的存活率和血液細菌定量。（a）鮭魚10oC下腹膜內感染殺鮭氣單胞菌（104 CFU 100 / g）后的存活率；（b）鮭魚感染殺鮭氣單胞菌第5天和第10天血液中活殺鮭氣單胞菌的檢測。
圖6. 殺鮭氣單胞菌體內感染鮭魚紅細胞的檢測。外周血涂片檢查。（a）未感染殺鮭氣單胞菌的鮭魚紅細胞；（b）殺鮭氣單胞菌感染第5天的鮭魚紅細胞（1000x）;（c）鮭魚紅細胞感染殺鮭氣單胞菌的細胞內定位放大。將所有細胞風干固定2小時后用Giemsa染色。
為了確定體外結果是否具有生物學意義，用鮭魚幼魚進行感染實驗，并在外周血紅細胞中評估了紅細胞內細菌的存在。鮭魚腹腔注射感染殺鮭氣單胞菌后5-8天表現出癤瘡癥狀，首次死亡發生在8 dpi，死亡持續到13 dpi。30 dpi時的平均生存率為8.6％（圖5a）。在5和10 dpi時觀察到細菌血癥（圖5b），并觀察到紅細胞內殺鮭氣單胞菌（圖6）。
結論
本項研究發現大西洋鮭紅細胞具有吞噬能力（圖1-3），但低于原代巨噬細胞。盡管鮭魚紅細胞具有吞噬細菌和顆粒的能力（圖2-4），但殺鮭氣單胞菌在感染動物的紅細胞和血液中仍處于可培養狀態（圖1b）。巧合的是，所有出現菌血癥的感染魚在接下來的3天內死亡（圖5a），在所有樣品魚中均觀察到紅細胞中存在殺鮭氣單胞菌（圖6b，c），并伴有感染過程。這些結果描述了殺鮭氣單胞菌的新型感染形式。
我們的數據表明，殺鮭氣單胞菌不會殺死鮭魚原代紅細胞（圖1a），但會侵入紅細胞內（圖1‒6）。這些結果說明殺鮭氣單胞菌可能會利用紅細胞逃避宿主防御機制（例如補體溶解，循環吞噬細胞，抗體或抗菌肽），并獲得由宿主螯合的營養物質（如鐵）。而且，殺鮭氣單胞菌的紅細胞內相對有益于細菌在整個宿主組織中的增殖。
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